案例解析：miR167-ARF3/30-多胺氧化酶 1 模块赋予玉米对MCMV的抗性 | 转录调控专题

论文标题：Maize miR167-ARF3/30-polyamine oxidase 1 module-regulated H₂O₂ production confers resistance to maize chlorotic mottle virus

刊登日期：2022年02月

发表杂志：Plant Physiology

影响因子：8.005

研究机构：中国农业大学

技术手段：降解组测序

文献地址：https://doi.org/10.1093/plphys/kiac099

前言

玉米是最重要的谷物作物之一，约占世界粮食产量的42%。然而玉米致死性坏死（MLN）对数百万小农的粮食安全和生计构成了巨大威胁。MLN是由玉米褪绿斑驳病毒（MCMV）和马铃薯Y病毒科（Potyviridae）复合侵染产生。因此，MLN爆发的关键因素是MCMV的出现。

MCMV编码七种蛋白质，其中p32蛋白与症状的形成有关，p31蛋白是MCMV主要致病性的决定因素，它可以劫持玉米过氧化氢酶（ZMCAT）以减弱水杨酸（SA）介导的防御反应。然而，关于MCMV感染的分子机制仍知之甚少。

微小RNA（microRNA, miRNA）是一类21~26 nt的小RNA，具有调控生长发育、抵抗生物胁迫的作用。miR167是一种在植物中被广泛研究的小RNA，它以ARF基因为靶点调节各种生物过程。

PAOs参与调节H₂O₂产生以及调节生长、防御反应、程序性细胞死亡和伤口愈合的功能。目前为止，还没有研究报道ZMPAO在玉米生物胁迫响应中的作用。

近日，中国农业大学在Plant Physiology发表了题为“Maize miR167-ARF3/30-polyamine oxidase 1 module-regulated H₂O₂ production confers resistance to maize chlorotic mottle virus”的研究论文，揭示了Zma-miR167-ZmARF3/30模块通过调节ZmPAO1的表达来抑制MCMV感染。

1. Zma-miR167在MCMV感染时上调并赋予玉米对MCMV感染的抵抗力

为了研究Zma-miR167在MCMV感染过程中的作用，作者使用了之前生成的两个pre-MIR167b过表达转基因玉米株系（OE2，OE3）。与WT植株相比，Zma-miR167表达水平显著性增加。MCMV感染使WT植株产生明显的褪绿和斑驳症状。在OE2和OE3植株中，MCMV gRNA和CP的表达水平显著性下降。这些结果清楚地表明，Zma-miR167过表达抑制了玉米中MCMV的感染。

2. 玉米品系中Zma-miR167的基础水平对MCMV的抗性具有正调控作用

为了研究Zma-miR167在基础水平是否有助于玉米育种株系对MCMV的抗性，作者分别在3个敏感株系（B73、W22和Z58）和3个抗性株系（VR-01、VR-02和VR-03）上建立了MCMV的侵染试验。抗性株系检测到的Zma-miR167 水平比敏感株系高2 - 3倍。MCMV感染后，3个抗性株系上叶的症状均比3个敏感株系轻。与敏感品系相比，抗性品系的MCMV gRNA和CP水平显著性下降。这表明Zma-miR167的基础水平对MCMV感染具有正向调节的作用。

3. 在玉米中Zma-miR167直接靶向抑制ZmARF3和ZmARF30的表达

虽然ARF6、ARF8和IAR3 mRNA上的miR167靶点在进化距离较远的植物物种中保守，但Zma-miR167是否靶向于玉米ARFs仍有待确定。为鉴定Zma-miR167的靶基因，利用WMD3和基于B73_Refgen_V4的TargetMiRna两个在线工具预测其靶基因。结果显示，ZmARFs 3、9、16、18、22、30和34均含有Zma-miR167结合位点，相应的靶序列分析显示，这些ZmARFs中只有Zma-miR167靶向位点5’末端的第一个核苷酸不同。系统发育分析表明，ZmARF3和ZmARF30均与拟南芥AtARF8同源，ZmARF9、16、18、22和34与AtARF6聚类。

随后，对OE2和敲低Zma-miR167的植株提取出的总RNA进行降解组测序，发现ZmARF3和ZmARF30各有一个峰值，表明Zma-miR167在其上有一个切割位点。对于其他被预测为Zma-miR167靶标未检测到明显的拼接峰。然后，5’RNA连接酶介导的cDNA末端扩增实验证实ZmARF3和ZmARF30可以被Zma-miR167直接靶向。

为了进一步研究Zma-miR167对靶基因表达的影响，作者测定了ZmARFs 3和30在OE2和Zma-miR167敲除植株叶片中的表达量。与WT相比，ZmARFs 3和30的表达量均被显著抑制。相比之下，Zma-miR167敲除植株中这两个ZmARF基因的表达水平显著提高。此外，瞬时切割实验表明，ZmARF3-eGFP和ZmARF30-eGFP的绿色荧光强度在Zma-miR167表达增加后急剧降低。在ZmARF3Res-eGFP抗性形态浸润后，叶片的荧光强度没有变化，相应的蛋白水平与荧光观察结果相似。这些结果一致支持Zma-miR167可以通过直接靶向ZmARF3和ZmARF30抑制其表达。

4. ZmARF3和ZmARF30基因敲除抑制了MCMV对玉米的感染

为了确定ZmARF3和ZmARF30在玉米MCMV感染中的作用，作者采用MCMV为基础的病毒诱导基因沉默（VIGS）载体对它们进行沉默。由于ZmARF3和ZmARF30具有较高的核苷酸序列相似性（88.53%），因此选择了一个保守的256 bp的片段标记ZmARF3和ZmARF30，并且没有预测到脱靶现象。在MCMV感染后，在ZmARF3/30-knockdown植株（CMV-ZmARF3/30）中观察到的症状比对照植株（CMV-GFP254）要轻得多。以7 dpi采收2片系统侵染叶片，测定ZmARF3/30的沉默效率和MCMV基因组积累水平。结果显示，在ZmARF3/30基因敲除的植株中，ZmARF3和ZmARF30基因的相对表达量分别显著降低。且MCMV gRNA水平也显著性降低。在ZmARF3/30敲除植株中，MCMV CP表达水平的也显著性降低。

5. Zma-miR167调控的基因在氧化还原过程中富集

为了进一步分析Zma-miR167介导的信号级联，作者进行了RNA-Seq来分析由ZmamiR167过表达或Zma-miR167敲低引起的差异表达基因。结果表明由Zma-miR167-ZmARF3/ 30介导的DEGs中，有7个DEGs参与氧化还原过程，其中茉莉酸合成基因、苯并恶唑锌合酶基因、过氧化氢产生基因与抗病相关。

6.ZmARF3和ZmARF30直接结合到ZmPAO1启动子，激活其表达

作者通过深入研究Zma - miR167 - ZmARF3 /30介导的反MCMV信号级联。由于H₂O₂的积累促进了MCMV的感染，作者推测MCMV的感染水平与玉米体内的H₂O₂水平有关。同时，PAOs可以催化亚精胺和精胺氧化生成H₂O₂。作者将ZmPAO1用于Zma-miR167-ZmARF3/ 30介导的抗MCMV信号的研究。为了验证ZmARF3或ZmARF30是否可以直接结合到ZmPAO1的启动子上，作者采用DAP-qPCR和电泳迁移率转移试验(EMSA)。结果表明ZmPAO1启动子具有很强的亲和力且ZmARF3和ZmARF30均强结合生物素探针，这表明ZmARF3或ZmARF30可以直接结合到ZmPAO1的启动子上。

接下来，作者测试了ZmARF3/30是否能够激活ZmPAO1的转录。当ZmPAO1启动子与ZmARF3或ZmARF30结合时，观察到大量的荧光素酶活性，对照组未观察到化学发光。这些结果表明，ZmARF3和ZmARF30可以直接结合ZmPAO1启动子并激活其表达。

为了进一步揭示ZmARF3/30与ZmPAO1的调控关系，作者进行了生长素处理实验。IAA处理后，ZmARF3、ZmARF30和ZmPAO1的相对转录水平均迅速升高。IAA处理后2 ~ 6 h，ZmARF3表达水平最高，ZmPAO1表达水平较IAA处理后6 h迅速升高。此外，在OE2植株和CMV-ZmARF3/30中，ZmPAO1 的表达水平降低，而在Zma CMV-STTM167中，ZmPAO1的表达水平增加。总之，Zma-miR167-ZmARF3/30模块通过结合ZmPAO1启动子直接调节ZmPAO1的表达。

7. 沉默ZmPAO1转录本或抑制ZmPAO活性可抑制MCMV感染

为了确定ZmPAO1在MCMV感染中的作用，作者将ZmPAO1沉默。与CMV-GFP254相比，CMV-ZmPAO1组MCMV感染症状明显较轻。与对照植株相比，ZmPAO1沉默植株中ZmPAO1的转录水平显著性降低。同样，敲除ZmPAO1的表达显著降低了MCMV gRNA和CP的水平。

为了研究ZmPAOs活性是否与MCMV感染有关，作者测量了MCMV感染后WT和Zma-miR167-OE株系中ZmPAOs的总活性。结果显示，MCMV感染使WT植株ZmPAOs活性在9和12 dpi上调，而在Zma-miR167-OE株系中，ZmPAOs活性在5和9 dpi保持不变，甚至在12 dpi时OE3植株ZmPAOs活性下降。为了进一步证实ZmPAOs活性参与了MCMV的感染，作者使用ZmPAOs活性抑制剂瓜扎丁(Guazatine)治疗玉米植株。瓜沙丁治疗显著降低了MCMV CP水平，揭示ZmPAOs活性是MCMV有效感染所必需的。

测量H₂O₂水平结果显示，ZmPAO1沉默植株中H₂O₂降低，而Zma - miR167敲除植株中H₂O₂显著升高。有趣的是，MCMV感染并不影响WT植株的H₂O₂水平，但导致Zma-miR167-OE株系的H₂O₂水平升高。考虑到WT植株在MCMV感染后ZmPAOs活性显著增加，而ZmCATs的抑制活性可促进MCMV的积累，作者推测可能需要一定水平的H₂O₂才能有效感染MCMV 。为了验证这一点，在MCMV接种4 dpi时，外源喷施H₂O₂。10 μM和100 μM H₂O₂处理植株的症状明显比H₂O处理，1 μM和1 mM H₂O₂处理植株更严重。在10 μM和100 μM H₂O₂处理时，MCMV CP水平显著性提高，但在1 μM和1 mM H₂O₂处理时没有显著变化。这揭示了一定水平的H₂O₂才可促进MCMV感染。

8. MCMV编码的p31蛋白直接靶向并增强ZmPAO1酶活性

以上结果表明，高水平的Zma-miR167抑制了MCMV的感染。然而，即使在过表达Zma-miR167的植物中，MCMV也能保持较低的感染水平，这表明MCMV采用了一种反防御机制。为了研究这种抵消作用，通过酵母双杂交(Y2H)试验筛选了ZmPAO1和7个MCMV编码蛋白之间可能的相互作用。结果表明，ZmPAO1可以与MCMV编码的p31特异性相互作用。ZmPAO1和p31之间的物理相互作用也在玉米原生质体中通过双分子荧光互补实验得到了验证。共转染ZmPAO1和p31后，玉米细胞胞质中出现了强烈的点状金星荧光信号。GST - pulldown实验和Co-IP实验也验证了ZmPAO1在体外和体内均可直接与MCMV p31相互作用。

作者进一步的研究ZmPAO1和p31的亚细胞共定位，结果显示，单个GFP-p31定位于细胞质和细胞核中；单个ZmPAO1- dsred在细胞质中呈斑点状分布。同时，GFP-p31与ZmPAO1-dsRed共定位于细胞质，呈簇状点样分布。为了进一步明确ZmPAO1在玉米细胞中的定位，作者将表达ZmPAO1- dsRed的质粒包被金颗粒轰击进入玉米叶片中。轰击24 h后，玉米叶肉细胞胞质中可以观察到ZmPAO1-dsRed，并呈样簇状分布。综上所述，这些数据表明ZmPAO1与MCMV p31相互作用改变了其在玉米细胞中的分布。

接下来，作者试图分析p31结合ZmPAO1的生物学重要性。作者在体内测定了p31对ZmPAO1酶活性的影响。通过与GFP-p31或GFP共同过表达ZmPAO1- flag，分析ZmPAO1的酶活性。结果表明，与GFP-p31共表达时，ZmPAO1的酶活性比与GFP对照共表达时显著性提高。为了进一步确定p31是否能直接提高ZmPAO1的酶活性。DAB染色显示，GFP-p31与ZmPAO1- flag共表达增加了H₂O₂的产生，揭示了GFP-p31可能增强ZmPAO1活性。从大肠杆菌中分离纯化重组GST-ZmPAO1和His-p31，混合检测到了ZmPAO1的酶活性，且His-p31使ZmPAO1的酶活性显著性提高。以上结果表明p31能直接结合ZmPAO1并增强其酶活性，揭示p31可能对ZmPAO1具有稳定作用，维持ZmPAO1的酶活性。为了验证这一点，作者通过增加GFP-p31的浓度来表达ZmPAO1-Flag，并以GFP作为对照。结果显示，随着GFP-p31的表达量的增加，ZmPAO1-Flag的积累水平上调，而GFP的表达量的增加对ZmPAO1-Flag的蛋白水平没有影响。综上所述，p31通过维持ZmPAO1的稳定性来提高ZmPAO1的酶活性。

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